1859年（安政六年），江戶道場破敗之際，土方歲三在挑戰試衛館時敗于近藤勇劍下，轉而拜入其門下修行。數年后，試衛館成員響應幕府招募組成浪士組前往京都執行警護任務。彼時的京都各方勢力交織，佐幕、攘夷與倒幕派系在暗殺陰謀中共存。土方等人參與組建壬生浪士組，以取締攘夷派為名展開行動。該組織由芹澤鴨與近藤勇分任局長、副長，土方則與山南敬助及芹澤派新見錦共同執掌副長之職。隨著試衛館出身的近藤-土方派與芹澤派在政治立場和權力分配上的矛盾激化，兩派圍繞組織主導權展開激烈斗爭。最終通過肅清芹澤鴨一系勢力，近藤派確立絕對領導地位，并于元治元年（1864）將組織更名為世人熟知的新選組，由此開啟其在京都更為血腥的鎮壓時代。