公元前480年，波斯帝國薛西斯一世（羅德里戈·桑托羅飾）率三十萬大軍入侵希臘，由斯巴達國王列奧尼達（杰拉德·巴特勒飾）統率的三百精銳戰士與希臘聯軍四千余人奉命鎮守戰略要地溫泉關。因叛徒泄露地形情報，波斯軍隊突破希臘防線形成合圍之勢。為保存聯軍主力，列奧尼達果斷命令其余部隊撤退，親率三百斯巴達勇士留守斷后。面對數十倍于己的敵軍，列奧尼達與三百壯士在狹窄關隘中浴血奮戰兩晝夜，以驚人戰力重創波斯軍隊并擊斃其兩名皇族將領。最終三百勇士全員壯烈犧牲，成功延緩波斯大軍進軍速度并使其折損兩萬余人。此役雖以希臘守軍覆滅告終，但斯巴達戰士的決死抵抗成為激勵希臘諸城邦聯合抗敵的精神象征。