彼得·帕克（安德魯·加菲爾德飾）自幼因父親理查德的神秘失蹤與父母分離，由叔叔本（馬丁·辛飾）和嬸嬸梅撫養長大。成年后偶然發現父親遺留的公文包與奧斯庫公司標識，循著叔叔提供的線索前往拜訪其父前同事科特·康納斯博士（瑞斯·伊凡斯飾）。在公司實驗室尋找證據時意外被轉基因蜘蛛咬傷，身體產生超能力后經康納斯博士指導逐步掌握技能。隨著與校報編輯格溫·斯黛茜（艾瑪·斯通飾）的交往加深，彼得開始思考能力與責任的關系。某日目睹叔叔本因自己過錯死于劫匪槍下，內心深受震撼，最終領悟"能力越大責任越大"的真諦。與此同時康納斯博士為治愈斷臂秘密進行蜥蜴基因實驗，導致自身變異成威脅全城的蜥蜴人。彼得不得不在拯救市民與消滅宿敵間抉擇，最終以本叔遺言為信念，在摧毀康納斯的基因擴散裝置后放走對方接受法律審判，用蜘蛛絲懸吊在紐約樓宇間開啟英雄征程。